Целевой рабочий процесс секвенирования РНК на нанопорах, разработанный Кайли Монтгомери (Kylie Montgomery) и ее коллегами из Университетского колледжа Лондона (Великобритания*), помогает исследователям изучать самые сложные случаи редких заболеваний. В недавно опубликованной работе команда разработала и представила RAPID — конвейер анализа РНК для интегрированной диагностики (RNA analysis pipeline for integrated diagnostics).
RAPID представляет собой сквозной рабочий процесс «от образца до результата», в котором используется секвенирование кДНК на нанопорах для получения почти полноразмерных транскриптов и выявления аномалий сплайсинга, которые трудно разрешить с помощью традиционных методов. Примененный ретроспективно к шести ранее недиагностированным случаям редких заболеваний, RAPID дал результаты в каждом исследовании, помогая подтвердить варианты, нарушающие сплайсинг, определить кандидатные регионы для последующего анализа ДНК или исключить гены, которые вряд ли являлись причиной заболевания.
Мы поговорили с Кайли о ее пути к созданию RAPID, о трудностях исследования нераспознанных случаев редких заболеваний и о том, почему она захотела сделать свой рабочий процесс доступным для всех.
*Исследование проводилось в Университетском колледже Лондона, Великобритания. С тех пор некоторые члены команды перешли в Британский институт исследований деменции в Кембридже, Великобритания.
Почему именно исследования редких заболеваний?
До начала работы над кандидатской диссертацией Кайли работала в диагностических лабораториях молекулярной патологии сначала в Новой Зеландии, а затем в Великобритании. Позже она стала клиническим исследователем и обнаружила, что ее все больше привлекает интерпретация вариантов и задача поиска ответов для семей, столкнувшихся с редкими заболеваниями. Эта работа включала участие в Проекте 100 000 геномов в больнице Грейт-Ормонд-стрит, где она воочию увидела как сильные стороны, так и ограничения современных геномных подходов.
«Со временем у меня стало накапливаться разочарование, когда ты не можешь уделить время, энергию и ресурсы тем случаям, по которым не удается поставить диагноз»
«Со временем у меня стало накапливаться разочарование, когда ты не можешь уделить время, энергию и ресурсы тем случаям, по которым не удается поставить диагноз»
Для Кайли неразрешенные случаи стали тем, что невозможно игнорировать. В 2022 году она перешла в академическую среду, присоединившись к группе секвенирования в Университетском колледже Лондона (Великобритания), где работа с огромным разнообразием образцов и исследовательских задач помогла сформировать ее представление о том, как секвенирование Oxford Nanopore может поддержать исследования редких заболеваний.
Ее кандидатская диссертация, выполненная под руководством Мины Ритен (Mina Ryten), Эмиля Густавссона (Emil Gustavsson) и Генри Хоулдена (Henry Houlden), была посвящена тому, можно ли изучать редкие заболевания иначе, объединив информацию по функциональной геномике и данные на уровне транскриптов. В конце концов эта работа переросла в систему RAPID.
Почему необходим RAPID?
Многие пациенты, с которыми сталкивалась Кайли, уже прошли обширное генетическое тестирование. Секвенирование коротких ридов методом полноэкзомного или полногеномного анализа лишь сузило круг поиска до вероятного гена-кандидата, выявило вариант с неопределенным значением или обнаружило единственный вариант-кандидат при заболевании с рецессивным типом наследования. Недостающим элементом часто являлись функциональные доказательства.
«Нам просто не хватало этого последнего доказательства, чтобы довести дело до конца. Именно здесь в качестве следующего шага было внедрено нанопоровое секвенирование РНК»
«Нам просто не хватало этого последнего доказательства, чтобы довести дело до конца. Именно здесь в качестве следующего шага было внедрено нанопоровое секвенирование РНК»
Рабочий процесс RAPID возник из простого вопроса: если секвенирование ДНК уже зашло в тупик, может ли РНК дать следующую подсказку? По оценкам, до 62% патогенных однонуклеотидных вариантов влияют на сплайсинг, однако патогенность многих вновь обнаруженных или неаннотированных вариантов остается неопределенной.
Функциональная валидация часто необходима для определения того, изменяют ли эти варианты функцию гена, но традиционное секвенирование коротких ридов не позволяет точно реконструировать полноразмерные транскрипты для получения таких доказательств. Система RAPID была разработана как целевой рабочий процесс секвенирования «от образца до результата», использующий информацию на уровне транскриптов для выявления функциональных последствий генетических вариантов без необходимости использования крупных референсных когорт или подходов полнотранскриптомного секвенирования.
Почему именно нанопоровое секвенирование?
Для Кайли выбор нанопорового секвенирования определялся в равной степени как практичностью, так и производительностью. Вместо того чтобы разрабатывать рабочий процесс, требующий значительных инвестиций в новую инфраструктуру или специальной биоинформатической экспертизы, Кайли хотела создать то, что могло бы реально вписаться в условия общественного здравоохранения и трансляционных исследований.
«Это должно быть доступным и целевым. Применяя целевой подход, вы можете осуществлять мультиплексирование образцов, а это еще больше снижает затраты»
«Это должно быть доступным и целевым. Применяя целевой подход, вы можете осуществлять мультиплексирование образцов, а это еще больше снижает затраты»
Рабочий процесс RAPID объединяет целевую амплификацию кДНК с секвенированием Oxford Nanopore для захвата почти полноразмерных транскриптов из интересующих генов. Характеризуя полноразмерные изоформы, исследователи могут напрямую наблюдать события пропуска экзонов, дисбаланс транскриптов, признаки нонсенс-опосредованного распада и другие эффекты на уровне транскриптов, которые выходят за рамки того, что можно увидеть только по последовательности ДНК.
Ключевым мотивом было преодоление ограничений традиционного секвенирования РНК на основе коротких ридов. Как объясняют авторы в препринте, короткие риды дают лишь фрагментарное представление о структуре транскрипта, что затрудняет определение связности экзонов, событий альтернативного сплайсинга и сложных архитектур транскриптов. Риды произвольной длины от Oxford Nanopore предлагают более полную картину.
Создание рабочего процесса «от образца до результата»
Целью Кайли было создание сквозного рабочего процесса, который позволил бы исследователям пройти путь от образца до интерпретируемого результата как можно проще. Полученный рабочий процесс сочетает в себе целевую амплификацию кДНК, секвенирование Oxford Nanopore и модульный вычислительный конвейер, предназначенный для создания результатов, понятных клиницистам, и поддержки интерпретации изменений на уровне транскриптов. Протокол был разработан для поддержки интерпретации единичных образцов и интеграции с рабочими процессами, уже привычными для диагностических лабораторий.
Хотя технология Oxford Nanopore предназначена только для исследовательских целей, Кайли подчеркнула, что ее перенос в клинические условия следует привычному пути валидации. Прежде чем результаты будут использованы для поддержки принятия клинических решений, лаборатории проводят собственные валидационные исследования с использованием ранее охарактеризованных образцов и ортогональных методов, чтобы гарантировать соответствие рабочего процесса требуемым стандартам.
Рисунок 1. Сквозной рабочий процесс RAPID. (A) Подготовка библиотек кДНК-секвенирования из крови или фибробластов. B) Конвейер анализа данных, включая контроль качества, выравнивание на геном человека, сборку транскриптов и квантификацию. Рисунок взят из Montgomery et al. 2026 по лицензии Creative Commons Attribution CC BY 4.0.
Одним из самых заметных достижений исследования стала скорость. Рабочий процесс может выдавать информативные результаты в течение двух рабочих дней при подходящих условиях.
«К концу следующего дня вы уже можете получить данные, если знакомы с процессом, а целевой регион не слишком велик, что означает, что процесс ПЦР может быть относительно быстрым»
«К концу следующего дня вы уже можете получить данные, если знакомы с процессом, а целевой регион не слишком велик, что означает, что процесс ПЦР может быть относительно быстрым»
Для сравнения, Кайли отметила, что для сбора достаточного количества контрольных образцов для анализа коротких прочтений могут потребоваться месяцы или даже годы.
Что на данный момент удалось выявить с помощью RAPID?
Вместо того чтобы фокусироваться на одном типе вариантов, пилотное ретроспективное исследование шести случаев продемонстрировало несколько способов, которыми анализ РНК от Oxford Nanopore может способствовать изучению редких заболеваний.
В некоторых исследовательских образцах RAPID выявил ранее не наблюдавшиеся события сплайсинга, что позволило Кайли подтвердить, что варианты нарушают нормальный сплайсинг, и предоставило функциональные доказательства, которые послужили основанием для реклассификации вариантов. В других случаях изменения на уровне транскриптов указывали на регионы, требующие дальнейшего исследования ДНК, помогая сузить поиск глубоких интронных или регуляторных вариантов, которые ускользнули от предыдущих анализов.
Рабочий процесс также доказал свою ценность в случаях, когда наблюдался нормальный сплайсинг. Для одного исследовательского образца анализ транскриптов позволил исследователям с уверенностью исключить ген-кандидат и перенаправить усилия на другие направления.
Один особенно запоминающийся пример для Кайли связан с использованием нанопорового секвенирования как для ДНК, так и для РНК в рамках одного исследования. После того как секвенирование ДНК выявило глубокий интронный вариант-кандидат, таргетное секвенирование РНК выявило изменение транскрипта, не встречающееся в общедоступных базах данных. Полученные доказательства помогли объяснить биологические последствия варианта и в конечном итоге предоставили информацию, которую мог оценить врач.
Здесь Кайли представляет свое исследование на конференции London Calling 2026.
Сделать RAPID доступным для всех
С самого начала Кайли хотела, чтобы RAPID стал чем-то большим, чем просто разовый исследовательский проект. Лабораторный протокол был опубликован в открытом доступе через protocols.io, а вычислительный конвейер доступен на GitHub.
«Я бы хотела, чтобы другие использовали его, если захотят. Особенно в NHS, где полногеномное или полнотранскриптомное секвенирование не является наиболее рациональным использованием ресурсов. Протокол RAPID уже является таргетным и более простым для анализа»
«Я бы хотела, чтобы другие использовали его, если захотят. Особенно в NHS, где полногеномное или полнотранскриптомное секвенирование не является наиболее рациональным использованием ресурсов. Протокол RAPID уже является таргетным и более простым для анализа»
Эта открытость отражает одну из основных идей проекта: дать возможность другим лабораториям изучать анализ на уровне транскриптов без необходимости самостоятельно изобретать рабочий процесс. Кайли считает, что таргетные подходы, такие как RAPID, могут быть особенно ценны для условий с ограниченными ресурсами, и она надеется, что этот рабочий процесс поможет другим более эффективно исследовать сложные случаи.
Что дальше?
Кайли продолжает изучать, как анализ исследовательских образцов на уровне транскриптов с помощью RAPID может поддержать исследования редких заболеваний. У нее также готов к использованию набор Direct RNA Sequencing Kit. Поскольку многие интересующие Кайли транскрипты длиннее средних, конверсия в кДНК может приводить к смещению в сторону 3'-конца. Секвенируя нативные фрагменты РНК, она надеется улучшить покрытие 5'-конца и узнать больше о нетранслируемой области каждого транскрипта.
Больше всего Кайли вдохновляет возможность превращать сложные геномные вопросы в практические биологические выводы. Генерируя изоформы почти полной длины с помощью практичного рабочего процесса «от образца до ответа», RAPID демонстрирует, как нанопоровое секвенирование РНК может помочь исследователям более эффективно изучать нерешенные случаи редких заболеваний в будущем.
Чтобы узнать больше об исследованиях редких заболеваний с использованием нанопоровой технологии, прочитайте наш блог: окончание диагностической одиссеи начинается здесь.
Продукты Oxford Nanopore Technologies не предназначены для оценки состояния здоровья, а также для диагностики, лечения, облегчения, излечения или профилактики каких-либо заболеваний или состояний.
- Montgomery, K.-A. et al. RAPID: a targeted long-read RNA workflow for functional resolution of splicing variants in rare disease. Genome Med (2026). DOI: https://doi.org/10.1186/s13073-026-01754-3
