Микроскопия с использованием структурированного освещения и конфокальная микроскопия — это методы флуоресцентной визуализации, которые обеспечивают получение оптических срезов и улучшенную визуализацию образцов. В этой статье сравниваются SIM и конфокальная микроскопия по параметрам разрешения, оптического среза, скорости съемки, требований к образцам и типовых областей применения, чтобы помочь исследователям выбрать подходящий метод визуализации.
Основные выводы
- И SIM, и конфокальная микроскопия улучшают визуализацию флуоресцентных образцов, но используют разные подходы к получению оптических срезов и формированию изображения.
- Микроскопия со структурированным освещением (SIM) использует узорчатое освещение и вычислительную реконструкцию для улучшения информации об изображении, а в некоторых реализациях SIM — и разрешения.
- Конфокальная микроскопия отсекает внефокусный свет с помощью пространственной фильтрации, создавая четкие оптические срезы флуоресцентных образцов.
- Различия в скорости съемки, разрешении, толщине образца, фототоксичности и требованиях к реконструкции могут повлиять на выбор подходящего метода.
- Лучший метод флуоресцентной микроскопии зависит от образца, желаемого качества изображения, глубины визуализации, скорости сбора данных и исследовательских задач.
Исследователи, взвешивающие выбор между SIM и конфокальной микроскопией, на самом деле задаются вопросом о том, какая детализация им необходима по сравнению с тем, как быстро ее нужно получить, одновременно снижая фототоксичность. Оба метода повышают резкость флуоресцентных изображений за счет уменьшения размытия вне фокальной плоскости, но достигают этого совершенно разными средствами. Вот как работает каждый из них и в чем они обычно расходятся.
Что такое микроскопия со структурированным освещением (SIM)?
Микроскопия со структурированным освещением проецирует на образец узорчатую световую решетку вместо равномерного пучка. Когда этот узор накладывается на мелкие структуры в образце, возникают интерференционные паттерны, известные как муаровые полосы, которые несут информацию, выходящую за рамки того, что стандартный микроскоп может зафиксировать напрямую. Делается несколько снимков со смещенным и повернутым узором (обычно в нескольких ориентациях при нескольких фазовых положениях), после чего программное обеспечение реконструирует эти кадры в единое изображение с более высокой детализацией и, во многих конфигурациях SIM, с разрешением, превышающим стандартный дифракционный предел.
Поскольку в SIM используется обычное широкопольное освещение, а не сканирующий лазер, метод позволяет быстро получать изображения, а меньшая доза света на кадр делает его популярным выбором для длительной визуализации живых клеток без чрезмерного фотообесцвечивания.
Что такое конфокальная микроскопия?
Конфокальная микроскопия использует более прямой подход к устранению размытия. Сфокусированный лазер сканирует образец точка за точкой, а точечная диафрагма (пинхол) перед детектором блокирует любой свет, идущий из-за пределов фокальной плоскости. До детектора доходит только свет, находящийся в фокусе, что позволяет получить чистый оптический срез на данной глубине. Повторение сканирования на разных глубинах создает стопку резких изображений, которые можно объединить в полностью сфокусированный композит или 3D-реконструкцию.
Такое пошаговое сканирование обеспечивает конфокальной микроскопии высокую глубину дискриминации, особенно в более толстых образцах, и она остается одним из наиболее широко используемых методов флуоресцентной микроскопии в клеточной биологии и визуализации тканей именно потому, что эти характеристики глубины сохраняются даже при плотном мечении или сильном рассеянии света в образце.
SIM против конфокальной микроскопии: основные различия
Самая большая разница между микроскопией со структурированным освещением и конфокальной микроскопией заключается в том, как каждая из них отсекает сигнал вне фокуса. SIM полагается на узорчатый свет и последующую вычислительную реконструкцию, в то время как конфокальная микроскопия блокирует ненужный свет физически, через пинхол, непосредственно во время съемки. Это различие влияет на скорость, фототоксичность, разрешение и то, как каждый метод справляется с толщиной образца.
Оптический срез и качество изображения
Оба метода относятся к микроскопии оптических срезов, но качество среза различается в зависимости от толщины образца. Конфокальная микроскопия хорошо справляется с толстыми, плотно мечеными образцами, так как пинхол отсекает рассеянный свет независимо от того, сколько внефокусного сигнала окружает плоскость визуализации. SIM эффективно делает срезы более тонких образцов, но может испытывать трудности с очень толстыми или сильно рассеивающими свет тканями, где узорчатое освещение искажается до того, как достигнет детектора.
Разрешение и скорость съемки
SIM способна увеличивать разрешение за пределы стандартного дифракционного предела в определенных конфигурациях, часто примерно до двух раз по сравнению со стандартной широкопольной визуализацией. Разрешение конфокальной микроскопии сильно зависит от размера пинхола и числовой апертуры объектива, и хотя оно может быть превосходным, оно обычно не дотягивает до режимов максимального разрешения SIM. Скорость также, как правило, в пользу SIM, поскольку она захватывает все поле зрения целиком, а не сканирует точка за точкой, хотя процесс многокадровой реконструкции добавляет собственное время обработки.
Преимущества и ограничения микроскопии со структурированным освещением
Микроскопия со структурированным освещением предлагает высокую скорость получения данных и меньшую светоуго нагрузку на снимок, что помогает сохранять живые образцы в ходе повторяющихся сеансов визуализации. Она также захватывает все поле зрения при каждой экспозиции, а не строит изображение точка за точкой, поэтому исследования быстрых клеточных процессов методом таймлапс выигрывают от повышенного временного разрешения. Ее главным ограничением является чувствительность к артефактам реконструкции.
Если образец смещается во время нескольких экспозиций, необходимых для получения одного изображения, или если ткань сильно рассеивает свет, вычислительная реконструкция может внести ошибки, которые легко принять за реальные структуры. SIM также лучше работает на более тонких образцах, расположенных ближе к покровному стеклу, чем на толстых блоках тканей, а качество изображения может заметно ухудшаться при превышении образцом определенной глубины.
Преимущества и ограничения конфокальной микроскопии
Главное достоинство конфокальной микроскопии — надежная дифференциация по глубине в толстых или плотно меченых образцах, так как физический пинхол отсекает внефокусный свет независимо от рассеяния. Она также отлично справляется с широким спектром флуорофоров и многоканальной визуализацией, а регулировка размера пинхола дает пользователям прямой контроль над компромиссом между толщиной оптического среза и яркостью сигнала.
Обратной стороной являются скорость и световая нагрузка. Поточечное сканирование занимает больше времени, чем захват всего поля зрения за раз, а интенсивность лазера, необходимая для получения чистого сигнала, может вызывать стресс у живых клеток при длительных сеансах визуализации, что стоит тщательно взвешивать для экспериментов, требующих многократной съемки одного и того же живого образца.
Когда конфокальная визуализация является лучшим выбором
Конфокальная микроскопия обычно побеждает при работе с толстыми срезами тканей, 3D-реконструкциями сложных структур и любыми проектами, где стабильное получение оптических срезов важнее получения дополнительного разрешения. Лаборатории, уже использующие флуоресцентный микроскоп для рутинной визуализации, часто добавляют конфокальные возможности именно для работы с такими более толстыми или сложными образцами.
Выбор правильного метода флуоресцентной микроскопии
Выбор между этими методами флуоресцентной микроскопии начинается с образца и поставленной задачи. Тонкие живые образцы, где важны скорость и бережная визуализация, обычно склоняют выбор в пользу SIM. Толстые, сложные или сильно меченные образцы, где надежное оптическое срезание важнее дополнительного разрешения, обычно требуют конфокальной микроскопии. Некоторые лаборатории используют оба метода: SIM для получения мелких структурных деталей на тонких образцах и конфокальную микроскопию для работы с большой глубиной, выбирая тот метод, который подходит для конкретного образца, а не ограничиваясь одним подходом для всех случаев.
Часто задаваемые вопросы
SIM использует структурированное освещение и вычислительную реконструкцию для повышения разрешения и скорости, в то время как конфокальная микроскопия использует сканирующий лазер и физическую точечную диафрагму (пинхол) для отсечения внефокусного света. SIM обычно работает быстрее и бережнее с живыми образцами, в то время как конфокальный метод надежнее справляется с толстыми или густо меченными препаратами.
Она проецирует на образец структурированную световую сетку, делает несколько снимков по мере смещения и вращения паттерна, а затем реконструирует эти кадры в единое изображение с повышенной детализацией и разрешением.
Оптическое срезание — это способность получать четкое изображение на определенной глубине внутри образца без его физического разрезания, что позволяет объединять изображения с разной глубины в полностью сфокусированное изображение или 3D-модель.
Во многих конфигурациях SIM может достигать более высокого разрешения, чем стандартные конфокальные установки, хотя реальная разница зависит от конкретных систем, образцов и условий съемки.
- Универсальный флуоресцентный микроскоп серии BZ-X1000
Универсальный флуоресцентный микроскоп
серии BZ-X1000
