Внутри каждой живой клетки трудятся десятки тысяч различных типов белков: они переносят молекулярные грузы, передают сигналы, восстанавливают ДНК, а также принимают решения о том, должна ли клетка делиться или погибнуть. Большинство этих белков слишком малы, чтобы их можно было разглядеть с помощью существующих микроскопов. Те же белки, которые удается визуализировать, приходится извлекать из клетки и изучать изолированно — а не в той насыщенной и динамичной среде, которая управляет процессами жизни.
Ситуация вскоре изменится. В трех научных статьях исследователи из Biohub и UC Berkeley сообщают об успешных результатах применения технологии под названием «лазерная фазовая пластинка». В ней используется лазер, который в 100 миллионов раз ярче Солнца, что позволяет значительно улучшить контрастность изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Лазерная фазовая пластинка может сделать видимыми тусклые и размытые белки внутри неповрежденных клеток, в том числе многие белки, имеющие наибольшее значение для изучения человеческих заболеваний.
«Приблизительные оценки показывают, что с помощью существующей крио-ЭМ ученые могут визуализировать 10% протеома человека в очищенном виде — и менее 1% белков в их естественной клеточной среде», — говорит Скотт Фрейзер (Scott Fraser), вице-президент по динамической визуализации в Biohub. Ученые считают, что лазерная фазовая пластинка способна сделать видимыми более 50% белков, выполняющих клеточные функции.
«Это лишь первый шаг», — говорит Бриджит Каррагер (Bridget Carragher), один из основателей и технический директор направления визуализации в Biohub. — «Это как увидеть первый свет в телескопе. Наука, которую это сделает возможной, — она впереди».
В поисках более высокого контраста
Зимой 2019 года 25 физиков и инженеров собрались в Сан-Франциско на семинар, посвященный будущему электронной микроскопии. Они годами доводили метод крио-ЭМ до пределов его возможностей — улучшали камеры, программное обеспечение, методы подготовки образцов, — но уперлись в барьер. Несмотря на выдающиеся успехи в картировании структуры изолированных крупных белков, крио-ЭМ все еще не могла создавать четкие изображения с высоким контрастом для белков внутри клетки. Без возможности изучать и понимать белки в их естественной среде — когда они связываются, высвобождаются и толкаются среди тысяч соседей — разрабатывать терапевтические препараты крайне сложно.
Участники изложили многочисленные проблемы, с которыми они сталкивались, включая различные подходы к решению проблемы контрастности в крио-ЭМ. Затем Хольгер Мюллер (Holger Müller), физик из UC Berkeley, представил то, что многим показалось невыполнимым решением: способ улучшения крио-ЭМ с помощью пятна лазерного света, в миллионы раз более яркого, чем Солнце, для сдвига фазы электронных волн. Это позволяло преобразовывать невидимые различия в положении пиков и впадин электронной волны («фазы») в видимые различия контрастности изображения.
Эту задачу считали одной из сложнейших инженерных проблем в современной микроскопии. «Думаю, будет справедливо сказать, что все в этой области, когда идея была впервые предложена, подумали: ну, идея хорошая, но этого никогда не случится», — вспоминает Каррагер.
Но что, если это можно сделать? Для организатора семинара Стефани Отте (Stephani Otte), вице-президента Biohub по научным исследованиям в области визуализации, дерзкий вызов Мюллера стал призывом к действию. «Больше всего мне интересно брать то, что кажется невозможным, и воплощать это в реальность», — говорит она. — «Если кто-то говорит, что это нельзя сделать, для меня это сильнейший мотивационный фактор».
Ближе к концу семинара Отте задала группе вопрос: среди всех неудовлетворенных потребностей в этой области какой единственный инструмент быстрее всего продвинет науку вперед? Ответ был практически единогласным: лазерная фазовая пластинка Мюллера.
В течение следующих семи лет Biohub сделала ставку на эту идею, профинансировав работу Мюллера в Беркли, развивая ее и разработав второй вариант с двумя лазерами в своем исследовательском институте. Теперь обе версии микроскопа запущены. Наука, которую они откроют — систематический поатомный взгляд на внутреннее устройство клетки, — только начинается.
Разрешение клетки в атомных деталях
Решение Biohub пойти ва-банк в отношении технологии лазерных фазовых пластинок было связано не только с решением сложной инженерной задачи. Оно было направлено на понимание фундаментальной биологии, вызывающей заболевания, и поиск способов их лечения или предотвращения. Как отмечает Отте, история снова и снова доказывает, что биология следует за технологиями: когда появляются преобразующие инструменты, вся область совершает скачок вперед. Лазерная фазовая пластинка — это ставка Biohub на то, что такой момент настал для визуализации.
Обычная крио-ЭМ лучше всего работает с изолированными, очищенными белками — этот подход известен как микроскопия одиночных частиц. Параллельно с разработкой лазерной фазовой пластинки Мюллером созрел новый подход к крио-ЭМ, известный как криоэлектронная томография (крио-ЭТ). Крио-ЭТ строит трехмерные реконструкции структур внутри неповрежденных клеток, раскрывая не только форму белков, но и то, как они взаимодействуют со своими соседями.
Ученые Biohub уже использовали стандартную крио-ЭТ для визуализации структур, называемых лизосомами, в состоянии патологии. Лизосомы, которые раньше считались простыми клеточными «мусоросжигателями», теперь рассматриваются как сложные центры передачи сигналов. Дефекты в их работе связаны с десятками редких заболеваний, а также с распространенными нейродегенеративными состояниями, включая болезнь Альцгеймера. В экспериментах с мутировавшими лизосомами ученые Biohub видят, что с этими структурами что-то не так, но им не хватает высококонтрастных изображений, необходимых для того, чтобы показать, как именно конкретные дефекты влияют на белок-белковые взаимодействия.
«Мы открываем внутреннюю среду клетки». — Стефани Отте, вице-президент по научным исследованиям в области визуализации в Biohub
«Мы открываем внутреннюю среду клетки».
«Благодаря достижениям в области искусственного интеллекта этот прорыв в контрастности начнет открывать новый рубеж в структурной биологии, который позволит нам увидеть молекулярные машины клетки и то, как они собираются в гораздо более сложные и динамичные системы, а также понять, как они работают», — добавляет руководитель научных исследований Biohub Алекс Ривз (Alex Rives).
Решение физической проблемы 80-летней давности
Физики знали, как решить проблему контрастности для в остальном прозрачных образцов, по крайней мере в теории, с 1942 года. Именно тогда Фриц Цернике (Fritz Zernike), который позже получил Нобелевскую премию, описал подход фазового контраста к световой микроскопии. Введя небольшой оптический элемент на пути света, он показал, что невидимые ранее различия в фазе волны можно преобразовать в видимые различия яркости. Внезапно прозрачные образцы стали яркими.
В теории тот же трюк должен работать и для электронных микроскопов. Но создание фазовой пластинки для электронов превратилось в многолетнюю эпопею. Любой материал, помещаемый в электронный пучок, подвергается бомбардировке и повреждается, что вызывает непредсказуемое накопление заряда, портящее изображения. Одна из стратегий, разработанная в 2010-х годах и названная фазовой пластинкой Вольты, подошла ближе всего — в ней использовалась тонкая углеродная пленка, которая задействовала зарядку в качестве полезного свойства. Но ее нестабильность и размытие деталей высокого разрешения оставались постоянной проблемой.
Решение, предложенное Мюллером и его коллегой по Калифорнийском университете в Беркли Робертом Глейзером более 15 лет назад, заключалось в замене углеродной пленки мощным непрерывным лазером, что позволяло исключить любой материал, который может быть загрязнен или поврежден. Их уравнения предсказывали, что если сфокусировать лазер в точку внутри микроскопа, как раз там, где электронный пучок проходит через плоскость дифракции, это сможет изменить фазу электронов, не преграждая путь никакими твердыми телами.
Сложность заключалась в следующем: поскольку свет крайне слабо взаимодействует с электронами, лазер должен обладать невероятной интенсивностью — быть сфокусированным в пятно размером в микроны, работать часами и обладать стабильностью в пределах нанометров. Решением Мюллера стала так называемая резонаторная полость Фабри-Перо: пара зеркал, между которыми лазерный луч отражается туда и обратно примерно 10 000 раз. Каждое отражение усиливает интенсивность до тех пор, пока свет, сфокусированный между этими зеркалами, не достигнет примерно 100 миллионов раз интенсивности поверхности Солнца — это самый мощный непрерывный лазер в мире.
Зеркала, поддерживающие этот луч, должны быть отполированы до шероховатости поверхности менее одного ангстрема — примерно диаметр одного атома — и выровнены с точностью до 1/1000 градуса. Эти зеркала также должны быть идеально гладкими и чистыми; одна-единственная пылинка сгорит и разрушит их.
Мюллер и его коллеги также разработали конструкцию нового поколения, которую затем создал Biohub. Вместо одного лазерного луча в этой версии используются два пересекающихся лазерных луча в X-образной конфигурации — скрещенная лазерная фазовая пластинка, или xLPP. Двухлучевая конструкция имеет два существенных преимущества: она распределяет мощность лазера между двумя лучами, снижая нагрузку на каждую пару зеркал, и подавляет известный артефакт однолучевых конструкций, называемый «призрачными изображениями» (ghost images), — слабыми копиями высококонтрастных объектов, которые могут затенять еще более слабый биологический сигнал, который исследователи действительно пытаются увидеть. Количественная оценка того, насколько именно xLPP уменьшает призрачные изображения, является текущим проектом в Biohub.
Снаружи обе конфигурации микроскопа с лазерной фазовой пластинкой во многом похожи на другие криоэлектронные микроскопы. Это объясняется тем, что вся лазерная аппаратура помещается в устройство размером с чашку эспрессо, которое находится внутри колонны микроскопа.
Но двухлазерная конструкция Biohub, установленная в кастомный микроскоп Thermo Scientific Krios, была спроектирована так, чтобы работать достаточно надежно для ее последующего воспроизведения другими — это необходимое условие перед тем, как любая технология сможет выйти за рамки одной лаборатории в более широкое исследовательское сообщество. Параллельная разработка сократила то, что могло занять десятилетия, до семи лет, причем каждая команда специализировалась в своей области и делилась результатами в ходе сотрудничества.
Испытание лазерной фазовой пластинки
В трех статьях — одна опубликована в Science, демонстрирующая повышенный контраст для небольших белков с помощью однолазерной фазовой пластинки; одна опубликована в Nature Communications, излагающая теоретическую основу для xLPP; и одна preprint, описывающая разработку и внедрение xLPP специалистами Biohub, — исследователи из Калифорнийского университета в Беркли и Biohub сообщают, что лазерная фазовая пластинка как в однолазерной, так и в двухлазерной конфигурациях не просто теоретически элегантна. Она работает в современном крио-ЭМ и значительно улучшает контрастность на изображениях небольших белков.
В серии парных экспериментов команда из Беркли сначала получила изображения альдолазы — фермента среднего размера, который служит стандартным эталоном в крио-ЭМ, а затем гемоглобина, переносящего кислород белка в эритроцитах. Имея молекулярную массу всего 64 килодальтона, гемоглобин находится у нижней границы того, что способен разрешить традиционный крио-ЭМ, прямо на краю того, что эта область едва может разглядеть.
Когда поступили первые реальные результаты, команда Мюллера не стала праздновать, а затихла. Техник Джонатан Ремис потратил выходные на прогон изображений через программный конвейер. «Он просто замолкает на два дня», — вспоминает Джесси Чжан, постдок в лаборатории Мюллера и ведущий автор статьи в Science. «Мы такие: ну как данные? Все плохо? А он отвечает: „Что, если они настолько хороши, что я хочу убедиться в их правильности, прежде чем делиться ими с вами?“»
Тщательный анализ того стоил. Без лазера изображения выглядели как любые другие крио-ЭМ-изображения: пригодные для использования, но ограниченные. С включенным лазером разрешение улучшилось на величину до 44%. Белки стали резче. Особенности, которые раньше были размытыми, стали четко видимыми.
Тем временем Каррагер и ее команда, работая в Biohub, использовали двухлазерную фазовую пластинку для получения изображения апоферритина — небольшого белка, запасающего железо, — при разрешении 1,8 ангстрема, что приближается к теоретическому пределу разрешения этой технологии. Они также получили изображения замороженных бактерий E. coli, продемонстрировав, что лазер значительно повышает контрастность в условиях, когда традиционная визуализация оказывается неэффективной.
Эти ранние результаты, служащие доказательством концепции на очищенных белках и бактериях, подтверждают, что фазовая пластинка работает воспроизводимым образом в реальном микроскопе. Теперь исследователи из Biohub и Калифорнийского университета в Беркли тестируют технологию Biohub на сложных неповрежденных клетках, где, как ожидается, эта технология окажет наибольшее влияние с помощью крио-ЭТ.
Визуализация белков в контексте
За последнее десятилетие метод крио-ЭТ позволил заглянуть в такие уголки биологии, которые недоступны никаким другим методам: рибосомы, связанные с антибиотиками внутри бактерий, комплексы ядерных пор в их естественном контексте и механизмы, управляющие делением клеток. Но крио-ЭТ всегда была ограничена той же проблемой контрастности; более того, на самом деле образцы для томографии толще, сложнее и грязнее.
Фазовая пластинка, которая надежно повышает контрастность внутри клеток, станет революционной для этой области. «Настоящая перспектива — это томография», — говорит Дэвид Агард, научный директор-основатель направления визуализации в Biohub.
«Когда вы можете заглянуть внутрь клетки с фазовым контрастом — когда вы действительно можете наблюдать, как белки взаимодействуют с другими белками в контексте, — именно тогда биология начинает оживать», — говорит Дэвид Агард, научный директор-основатель направления визуализации в Biohub.
«Когда вы можете заглянуть внутрь клетки с фазовым контрастом — когда вы действительно можете наблюдать, как белки взаимодействуют с другими белками в контексте, — именно тогда биология начинает оживать».
Обе команды стремятся использовать преимущества лазерной фазовой пластинки для крио-ЭТ. «Крио-ЭТ сейчас находится в режиме демонстрации, а не в режиме экспериментов, потому что все происходит очень медленно», — говорит Каррагер. По ее словам, реальное использование этого метода будет означать, что исследователь сможет принести биологический вопрос в микроскоп, потратить несколько недель на сбор и анализ данных и приблизиться к ответу путем итераций, а не тратить годы на поиски ради одной-единственной структурной характеристики.
Лазерная фазовая пластинка на сегодняшний день является лучшим кандидатом в этой области для такого обновления, говорит Каррагер. Лучший контраст также позволяет исследователям компенсировать большую часть шума, присущего томографическим данным, точно так же, как усовершенствованные камеры совершили прорыв в крио-ЭМ одиночных частиц десять лет назад. «Благодаря колоссальной работе Biohub рутинная томография с использованием лазерной фазовой пластинки теперь стала вполне достижимой», — говорит Мюллер.
Biohub также работает над тем, чтобы преимущества этой технологии распространились на мировое научное сообщество. Все ее томографические данные, включая десятки тысяч аннотированных томограмм, находятся в свободном доступе для исследовательского сообщества через CryoET Data Portal с целью ускорения всего процесса крио-ЭМ-исследований для лабораторий по всему миру.
Больше, чем микроскоп
Biohub вложил значительные ресурсы в лазерную фазовую пластинку за последние семь лет не потому, что успех был гарантирован, а потому, что потенциальная выгода была достаточно велика, чтобы оправдать риск. «Слишком часто многообещающие технологии застревают между доказательством концепции и практическим внедрением — в «долине смерти», — говорит Отте. — Мы решили, что это слишком важно, чтобы допустить подобное».
Эта стратегия никогда не сводилась лишь к финансированию одной лаборатории. Это было сложное многолетнее сотрудничество с партнерами в области инженерии, оптики, программного обеспечения и электронной микроскопии. Лазерная фазовая пластинка лежит в основе более масштабной научной амбиции Biohub по созданию технологий, необходимых для ускорения науки, которая лечит или предотвращает болезни.
В апреле Biohub объявил о запуске инициативы Virtual Biology Initiative: пятилетней программы объемом 500 миллионов долларов США, направленной на создание новых наборов клеточных данных для обучения моделей ИИ, охватывающих уровни от молекулы до организма как в норме, так и при патологии. Лазерная фазовая пластинка будет иметь решающее значение для получения детальных изображений, необходимых для обучения этих моделей.
Лазерная фазовая пластинка в этом контексте является значительным шагом на пути к тому, чтобы сделать внутреннее пространство клетки понятным как для исследователей, так и для ИИ. Конечная цель — визуализация с атомным разрешением внутри интактных клеток и полный молекулярный атлас здоровья и болезней — все еще впереди. Но новый инструмент для ее достижения впервые стал реальностью.
