Внутри каждой живой клетки работают десятки тысяч различных типов белков: они транспортируют молекулярные грузы, передают сигналы, восстанавливают ДНК, решают, должна ли клетка делиться или умереть. Большинство этих белков слишком малы, чтобы их можно было визуализировать с помощью существующих микроскопов. Те, которые удается рассмотреть, приходится извлекать из клетки и изучать в изоляции — а не в той переполненной, динамичной среде, которая управляет жизненными процессами.
Ситуация вот-вот изменится. В трех статьях исследователи из Biohub и Калифорнийского университета в Беркли сообщают об успешных результатах применения технологии под названием «лазерная фазовая пластинка», в которой используется лазер, в 100 миллионов раз более яркий, чем Солнце, для значительного улучшения контрастности изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Лазерная фазовая пластинка может сделать видимыми ранее тусклые и размытые белки внутри неповрежденных клеток, включая многие белки, наиболее важные для понимания заболеваний человека.
«Грубые оценки показывают, что ученые могут визуализировать 10% человеческого протеома в очищенном виде с помощью существующей крио-ЭМ — и менее 1% белков в их естественной клеточной среде», — говорит Скотт Фрейзер, президент по динамической визуализации в Biohub. Ученые полагают, что лазерная фазовая пластинка может сделать видимыми более 50% белков, выполняющих клеточные функции.
«Это только первый шаг, — говорит Бриджит Каррагер, директор-основатель по техническим вопросам визуализации в Biohub. — Это как впервые увидеть свет через телескоп. Наука, которую это делает возможной, — это следующий этап».
В поисках более высокого контраста
Зимой 2019 года 25 физиков и инженеров собрались в Сан-Франциско на семинар, посвященный будущему электронной микроскопии. Они годами доводили метод крио-ЭМ до предела — улучшали камеры, программное обеспечение, подготовку образцов, — но уперлись в барьер. Несмотря на значительные успехи в картировании структур изолированных крупных белков, крио-ЭМ все еще не могла создавать четкие, высококонтрастные изображения белков внутри клетки. Без возможности изучать и понимать белки в их естественной среде — когда они связываются, высвобождаются, сталкиваются с тысячами соседей — крайне сложно разрабатывать терапевтические средства.
Группа изложила множество проблем, с которыми они столкнулись, включая различные подходы к решению проблемы контрастности в крио-ЭМ. Затем Хольгер Мюллер, физик из Калифорнийского университета в Беркли, представил то, что многим показалось невозможным решением: способ улучшения крио-ЭМ, использующий пятно лазерного света, в миллионы раз более яркое, чем Солнце, для сдвига фазы электронных волн, превращая невидимые различия в положении пиков и впадин электронной волны — ее «фазы» — в видимые различия в контрастности изображения.
Это широко считалось одной из самых сложных инженерных задач в современной микроскопии. «Думаю, будет справедливо сказать, что все в этой области, когда это было впервые предложено, подумали: ну, хорошая идея, но этого никогда не произойдет», — вспоминает Каррагер.
Но что, если это возможно? Для организатора семинара Стефани Отте, вице-президента Biohub по науке визуализации, дерзкий вызов Мюллера стал призывом к действию. «Больше всего меня интересует превращение того, что кажется невозможным, в реальность, — говорит она. — Если кто-то говорит, что это невозможно сделать, для меня это самый большой мотивирующий фактор».
Ближе к концу семинара Отте задала группе вопрос: из всех нерешенных задач в этой области, какой единственный инструмент быстрее всего продвинет науку вперед? Ответ был почти единогласным: лазерная фазовая пластинка Мюллера.
В течение следующих семи лет Biohub сделал большую ставку на эту идею, финансируя работу Мюллера в Беркли, развивая ее и разрабатывая второй, двухлазерный вариант в своем исследовательском институте. Теперь обе версии микроскопа запущены. Наука, которую они сделают возможной — систематический, поатомный взгляд на внутреннее устройство клетки, — только началась.
Разрешение клетки в атомных деталях
Решение Biohub полностью сосредоточиться на технологии лазерной фазовой пластинки было связано не только с решением сложной инженерной задачи. Речь шла о понимании фундаментальной биологии, лежащей в основе заболеваний, и поиске способов их лечения или предотвращения. Как отмечает Отте, история снова и снова показывает, что биология следует за технологиями: когда появляются трансформационные инструменты, область меняется. Лазерная фазовая пластинка — это ставка Biohub на то, что такой момент настал для визуализации.
Обычная крио-ЭМ лучше всего работает с изолированными, очищенными белками — подход, известный как одночастичная микроскопия. Параллельно с разработкой Мюллером лазерной фазовой пластинки созрел новый подход к крио-ЭМ, известный как криоэлектронная томография, или крио-ЭТ. Крио-ЭТ создает трехмерные реконструкции структур внутри неповрежденных клеток, раскрывая не только форму белков, но и то, как белки взаимодействуют со своими соседями.
Ученые Biohub уже использовали стандартную крио-ЭТ для визуализации структур, называемых лизосомами, в болезненных состояниях. Лизосомы, которые когда-то считались просто «мусоросборниками» клетки, теперь понимаются как сложные узлы передачи сигналов. Дефекты в их функционировании были связаны с десятками редких заболеваний, а также с распространенными нейродегенеративными состояниями, включая болезнь Альцгеймера. В экспериментах с мутировавшими лизосомами ученые Biohub видят, что с этими структурами что-то не так, но им не хватает высококонтрастных изображений, необходимых для того, чтобы показать, как конкретные дефекты влияют на белково-белковые взаимодействия.
«Мы открываем внутреннюю среду клетки». — Стефани Отте, вице-президент по науке визуализации в Biohub
«Мы открываем внутреннюю среду клетки».
«Благодаря достижениям в области ИИ этот прорыв в контрастности начнет открывать новые горизонты в структурной биологии, что позволит нам увидеть молекулярные машины клетки, то, как они собираются в гораздо более сложные и динамичные системы, и понять, как они работают», — добавляет руководитель научного отдела Biohub Алекс Ривз.
Решение 80-летней физической проблемы
Физики знали, как решить проблему контрастности для прозрачных образцов, по крайней мере теоретически, еще с 1942 года. Именно тогда Фриц Цернике, который позже получил Нобелевскую премию, описал метод фазового контраста для световой микроскопии. Вставив небольшой оптический элемент в путь света, он показал, что ранее невидимые различия в фазе волны можно преобразовать в видимые различия в яркости. Внезапно прозрачные образцы стали отчетливыми.
Теоретически тот же трюк должен работать и с электронными микроскопами. Но создание фазовой пластинки для электронов превратилось в многолетнюю сагу. Любой материал, помещенный в электронный пучок, подвергается бомбардировке и повреждается, вызывая непредсказуемую зарядку, которая портит изображения. Одна стратегия, разработанная в 2010-х годах, называемая фазовой пластинкой Вольта, подошла ближе всего — в ней использовалась тонкая углеродная пленка, которая использовала зарядку как преимущество. Но ее нестабильность и размытие деталей высокого разрешения оставались постоянной проблемой.
Решение, предложенное Мюллером и его коллегой из Калифорнийского университета в Беркли Робертом Глейзером более 15 лет назад, заключалось в замене углеродной пленки мощным непрерывным лазером, что позволило исключить любой материал, который может быть загрязнен или поврежден. Их уравнения предсказывали, что если лазер можно сфокусировать в точку внутри микроскопа, прямо там, где электронный пучок проходит через плоскость дифракции, это позволит сдвинуть фазу электронов, не помещая на пути ничего твердого.
Подвох заключался в том, что, поскольку свет почти не взаимодействует с электронами, лазер должен быть чрезвычайно интенсивным — сфокусированным в пятно размером в микроны, работающим часами и стабильным с точностью до нанометров. Решением Мюллера стал так называемый резонатор Фабри-Перо: пара зеркал, которые заставляют лазерный луч отражаться туда и обратно примерно 10 000 раз. Каждое отражение усиливает интенсивность до тех пор, пока свет, сфокусированный между этими зеркалами, не достигнет интенсивности, примерно в 100 миллионов раз превышающей интенсивность поверхности Солнца, — это самый яркий лазер непрерывного действия в мире.
Зеркала, поддерживающие этот луч, должны быть отполированы до шероховатости поверхности менее одного ангстрема — примерно диаметр одного атома — и выровнены с точностью до 1/1000 градуса. Эти зеркала также должны быть идеально гладкими и чистыми; даже одна пылинка сгорит и разрушит их.
Мюллер и его коллеги также разработали проект следующего поколения, который затем был реализован в Biohub. Вместо одного лазерного луча в этой версии используются два скрещенных лазерных луча в X-образной конфигурации — скрещенная лазерная фазовая пластина, или xLPP. Двухлучевая конструкция имеет два существенных преимущества: она распределяет мощность лазера между двумя лучами, снижая нагрузку на каждый комплект зеркал, и подавляет известный артефакт однолучевых конструкций, называемый «призрачными изображениями» — слабыми копиями высококонтрастных объектов, которые могут скрывать еще более слабый биологический сигнал, который исследователи пытаются увидеть. Количественная оценка того, насколько xLPP уменьшает количество призрачных изображений, является текущим проектом в Biohub.
Снаружи обе конфигурации микроскопа с улучшенной лазерной фазовой пластиной выглядят так же, как и другие криоэлектронные микроскопы. Это связано с тем, что весь лазерный аппарат помещается в устройство размером с чашку эспрессо, которое находится внутри колонны микроскопа.
Но двухлазерная конструкция Biohub, установленная в специализированном микроскопе Thermo Scientific Krios, была спроектирована так, чтобы работать достаточно надежно, чтобы другие могли в конечном итоге воспроизвести ее — необходимое условие перед тем, как любая технология перейдет из одной лаборатории в более широкое исследовательское сообщество. Параллельная разработка сократила то, на что могли уйти десятилетия, до семи лет, при этом каждая команда специализировалась, делясь результатами в рамках сотрудничества.
Испытание лазерной фазовой пластины
В трех статьях — одной, опубликованной в Science, демонстрирующей улучшенный контраст для малых белков с помощью однолазерной фазовой пластины; одной, опубликованной в Nature Communications, излагающей теоретическую основу для xLPP; и одной препринте, описывающем разработку и внедрение xLPP в Biohub — исследователи из Калифорнийского университета в Беркли и Biohub сообщают, что лазерная фазовая пластина, как в одно-, так и в двухлазерной конфигурациях, не просто теоретически элегантна. Она работает в современном крио-ЭМ и значительно улучшает контрастность изображений малых белков.
В серии парных экспериментов команда из Беркли сначала получила изображение альдолазы, фермента среднего размера, который служит стандартным эталоном в крио-ЭМ, а затем гемоглобина, белка, переносящего кислород в эритроцитах. С молекулярной массой всего 64 килодальтона гемоглобин находится у нижней границы того, что может разрешить обычная крио-ЭМ, прямо на грани того, что область едва может увидеть.
Когда пришли первые реальные результаты, команда Мюллера не праздновала, а замолчала. Техник Джонатан Ремис провел выходные, пропуская изображения через программный конвейер. «Он просто молчал два дня», — вспоминает Джесси Чжан, постдок в лаборатории Мюллера и ведущий автор статьи в Science. «Мы просто спрашивали: как там данные? Все плохо? А потом он говорит: «Что, если они настолько хороши, что я хочу убедиться в их правильности, прежде чем делиться ими с вами?»
Тщательный анализ того стоил. С выключенным лазером изображения выглядели как любые другие изображения крио-ЭМ: пригодные для использования, но ограниченные. С включенным лазером разрешение улучшилось на 44%. Белки стали четче. Особенности, которые были размытыми, стали ясно видны.
Тем временем, работая в Biohub, Каррагер и ее команда использовали двухлазерную фазовую пластину для получения изображения апоферритина — небольшого белка для хранения железа — с разрешением 1,8 ангстрема, приближаясь к теоретическому пределу разрешения технологии. Они также получили изображения замороженных бактерий E. coli, продемонстрировав, что лазер значительно повышает контрастность в условиях, когда обычная визуализация не справляется.
Эти ранние результаты, подтверждающие концепцию на очищенных белках и бактериях, доказывают, что фазовая пластина работает воспроизводимо в реальном микроскопе. Сейчас исследователи из Biohub и Калифорнийского университета в Беркли тестируют технологию Biohub на сложных, неповрежденных клетках, где, как ожидается, технология в конечном итоге окажет наибольшее влияние, с помощью крио-ЭТ.
Визуализация белков в контексте
За последнее десятилетие крио-ЭТ позволила заглянуть в биологию, недоступную никаким другим методам: рибосомы, связанные с антибиотиками внутри бактерий, ядерные поровые комплексы в их естественном контексте и механизмы, управляющие делением клеток. Но крио-ЭТ всегда была ограничена той же проблемой контрастности; более того, на самом деле, потому что томографические образцы толще, грязнее и сложнее.
Фазовая пластина, которая надежно повышает контрастность внутри клеток, стала бы трансформационной для этой области. «Настоящая перспектива — это томография», — говорит Дэвид Агард, директор-основатель Biohub по визуализации.
«Когда вы можете видеть внутри клетки с фазовым контрастом — когда вы можете действительно наблюдать, как белки взаимодействуют с другими белками в контексте — вот тогда биология начинает оживать». — Дэвид Агард, директор-основатель по визуализации в Biohub
«Когда вы можете видеть внутри клетки с фазовым контрастом — когда вы можете действительно наблюдать, как белки взаимодействуют с другими белками в контексте — вот тогда биология начинает оживать».
Обе команды стремятся использовать преимущества лазерной фазовой пластины для крио-ЭТ. «Крио-ЭТ сейчас находится в демонстрационном режиме, а не в экспериментальном, потому что все так медленно», — говорит Каррагер. Истинное использование этого метода, объясняет она, будет означать, что исследователь сможет принести биологический вопрос в микроскоп, потратить несколько недель на сбор и анализ данных и итеративно прийти к ответу, а не тратить годы, мучительно продвигаясь к одной структурной характеристике.
Лазерная фазовая пластина — лучший на сегодняшний день кандидат в этой области для такого обновления, говорит Каррагер. Улучшенный контраст также позволяет исследователям корректировать большую часть шума, присущего томографическим данным, точно так же, как улучшенные камеры открыли путь для одночастичной крио-ЭМ десять лет назад. «Благодаря огромной работе Biohub, рутинная томография с лазерной фазовой пластиной теперь находится в пределах досягаемости», — говорит Мюллер.
Biohub также работает над тем, чтобы преимущества этой технологии стали доступны мировому научному сообществу. Все данные томографии, включая десятки тысяч аннотированных томограмм, находятся в свободном доступе для исследователей через портал CryoET Data Portal с целью ускорения всего процесса криоэлектронной томографии (cryo-ET) в лабораториях по всему миру.
Больше, чем микроскоп
Biohub вложил значительные ресурсы в лазерную фазовую пластину за последние семь лет не потому, что успех был гарантирован, а потому, что потенциальная выгода была достаточно велика, чтобы оправдать риск. «Слишком часто многообещающие технологии застревают между этапом подтверждения концепции и реальным внедрением — в так называемой «долине смерти», — говорит Отте. — Мы решили, что это слишком важно, чтобы допустить подобное».
Стратегия никогда не заключалась только в финансировании одной лаборатории. Это было сложное, многолетнее сотрудничество с партнерами в области инженерии, оптики, программного обеспечения и электронной микроскопии. Лазерная фазовая пластина является основой более масштабных научных амбиций Biohub по созданию технологий, необходимых для ускорения науки, которая лечит или предотвращает заболевания.
В апреле Biohub объявил об инициативе Virtual Biology Initiative: пятилетнем обязательстве в размере 500 миллионов долларов по созданию новых наборов клеточных данных для обучения моделей ИИ, охватывающих уровни от молекулы до организма, как в состоянии здоровья, так и при заболеваниях. Лазерная фазовая пластина будет иметь решающее значение для получения детализированных изображений, необходимых для обучения этих моделей.
В этом контексте лазерная фазовая пластина является важным шагом к тому, чтобы сделать внутреннее устройство клетки понятным как для исследователей, так и для ИИ. Конечная цель — визуализация с атомным разрешением внутри неповрежденных клеток, создание полного молекулярного атласа здоровья и болезней — еще впереди. Но новый инструмент для достижения этой цели впервые стал реальностью.